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      科技動態

      青島能源所發明單細胞拉曼耦合培養技術(scRACS-Culture) 高效挖掘微生物組資源

      撰稿: 青島生物能源與過程研究所 發布時間:2022-10-31
         微生物組是自然界最基本、最寶貴的生物資源之一,其代謝功能直接影響著人體微環境與地球大環境的健康。因此,從微生物組中挖掘“特定代謝功能”的活體菌株資源,以保護和修復各種微生態系統,一直是業界孜孜以求的目標。近日,青島能源所與青島星賽生物等合作發明了單細胞拉曼耦合培養技術(scRACS-Culture),建立了直接從環境樣品出發、針對“原位”代謝功能、單細胞精度、免培養、免熒光標記的活體功能菌株挖掘儀器體系;進而聯合青島張村河水務有限公司、中科院廈門城市環境研究所、自然資源部第一海洋研究所等,示范了城市污水處理系統中解磷菌的高效挖掘。這一“先篩后養”的scRACS-Culture體系,突破了目前“先養后篩”傳統范式的原理性局限,為微生物組功能探測與資源挖掘提供了原創的儀器裝備,相關成果發表于ISME Communications。
      基于“先篩后養”的策略,單細胞拉曼耦合培養技術和儀器體系(scRACS-Culture)能夠全面高效地挖掘微生物組資源 
        長期以來,從環境乃至人體生態系統中識別與獲取活體功能菌株資源,主要遵循“先養后篩”的思路,這導致了三個原理性缺陷。第一,功能篩選的“片面性”:由于該思路中純培養是功能篩選的前提條件,因此篩選的對象僅限于通常僅占菌群物種多樣性中很小比例的可培養微生物。第二,功能評價的“失真性”:該思路通常評價的是純培養后、實驗室條件下的功能,而不是最為關鍵、真正重要的“原位”功能,而前者與后者經常迥異。第三,菌株培養的“盲目性”:該思路目標通常是從菌群中培養出所有細胞,而不是有靶向性地針對目標功能細胞進行培養,導致大量資源浪費于非目標功能細胞的培養上。
        為了克服這三個原理性缺陷,單細胞中心荊曉艷高級工程師和公衍海助理研究員帶領的研究小組,基于單細胞中心提出的元拉曼組原理和青島星賽生物的單細胞拉曼光鑷分選儀器,發明了菌群中功能單細胞“先篩后養”的新策略。首先,從環境樣品中,不經培養而直接根據單細胞拉曼光譜來識別具特定“原位”代謝功能的目標微生物細胞;其次,基于能夠高度保持細胞活性的“液相單細胞拉曼分選耦合培養芯片”(RAGE-Culture芯片),根據拉曼光譜來高效地分選出這些目標細胞,并對接與代謝表型組信息一一對應、每孔一個細胞(One-Cell-One-Tube)的并行化單細胞培養,從而完成基于“原位”代謝功能的活體功能菌評價和獲取。此外,上述拉曼分選出來的功能單細胞也可以和“液相單細胞拉曼分選耦合核酸擴增芯片”(RAGE-Seq芯片)對接,實現高覆蓋度(可高達100%)的單細胞基因組測序,支撐完整、精準的全基因組代謝重建。
        磷既是維持作物種植、養活全球人口的關鍵營養元素,也是造成水體污染的重要原因。水體及土壤中的磷源包括可溶磷和不可溶磷(包括無機不可溶磷源和有機不可溶磷源),其中只有可溶態磷能夠被生物利用。而解磷菌能夠把不可溶磷轉化為可溶解態磷源,因此,挖掘在水體、土壤等環境中“原位”行使解磷功能的微生物,具有重要的研究意義和產業價值。為了識別污水微生物組中的原位解磷菌,研究小組利用以Ca3(PO4)2為唯一無機磷源或以卵磷脂為唯一有機磷源的污水樣本(預先去除可溶性磷源),結合D2O孵育,從而通過單細胞拉曼光譜中C-D特征峰的強弱,在單細胞精度定量表征污水中微生物的解磷活性,進而建立了原位解磷菌的單細胞識別-分選-培養流程。運用這一scRACS-Culture體系,研究小組在青島張村河水務有限公司的污水處理池中,原位識別、分選和培養出了Comamonas spp.、Acinetobacter spp.、Enterobacter spp.和Citrobacter spp.等高效原位有機解磷菌。重要的是,其原位解磷活性均比實驗室純培養條件下高出一到兩倍,凸顯了“先篩后養”策略對菌株“原位”功能認知與評價的重要意義。
        同時,研究人員運用scRACS-Seq,還發現了一類在污水中原位高效溶解不可溶有機磷源、在實驗室條件下尚難以純培養的解磷菌新類群Cutibacterium spp.。精確到一個細菌細胞的高覆蓋度基因組重建表明,它們通過分泌金屬磷酸酯酶(MPP)、細胞壁錨定5’-核苷酸酶(ushA編碼)和質膜定位的PstSCAB-PhoU轉運系統,來高效溶解和清除污水中的胞外磷酸鹽。
        由于scRACS-Culture的功能篩選不依賴于細胞純培養,因此能基于“原位”功能、針對菌群中所有的生物多樣性進行挖掘,并精準聚焦于目標功能細胞進行培養條件優化。這些特色克服了功能篩選片面性、功能評價失真性、菌株培養盲目性這三個傳統“先養后篩”策略的潛在缺陷。
        除了免培養、無需熒光標記、活體表征等特色,單細胞拉曼光譜還具有信息豐富的優勢,能“全景式”地刻畫底物代謝、產物合成、環境應激等代謝表型組,還可區分微生物細胞或腫瘤細胞的種類,因此scRACS-Culture對于人體、動植物和微生物細胞資源產業具有共性方法學意義。下一步,研究人員將基于流式拉曼分選儀FlowRACS,開發高通量的scRACS-Culture/Seq技術體系,服務于規?;纳滴镔|功能探測和資源挖掘。
        該工作由青島能源所單細胞中心徐健研究員和馬波研究員主持,與青島張村河水務有限公司荊玉姝高級工程師、牟潤芝部長、中科院廈門城市環境研究所崔麗研究員、自然資源部第一海洋研究所曲凌云研究員等合作完成。該工作得到了國家重大科學儀器研制項目、國家重點研發計劃、國家自然科學基金等的支持。
        Xiaoyan Jing#, Yanhai Gong#, Huihui Pan, Yu Meng, Yishang Ren, Zhidian Diao, Runzhi Mu, Teng Xu, Jia Zhang, Yuetong Ji, Yuandong Li, Chen Wang, Lingyun Qu, Li Cui, Bo Ma*, Jian Xu*. Single-cell Raman-activated sorting and cultivation (scRACS-Culture) for assessing and mining in situ phosphate-solubilizing microbes from nature. ISME Communications, 2022. 
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